微信公眾號(hào)“中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所”7月8日消息，李偉與周琪團(tuán)隊(duì)開發(fā)逆轉(zhuǎn)座子基因工程新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)全RNA介導(dǎo)的基因精準(zhǔn)寫入。

基因組DNA是生命的藍(lán)圖，對(duì)基因組DNA實(shí)現(xiàn)任意尺度的精準(zhǔn)操作代表對(duì)生命藍(lán)圖進(jìn)行修改繪制的底層能力，是基因工程技術(shù)發(fā)展的核心。以CRISPR基因編輯技術(shù)為代表的技術(shù)進(jìn)步實(shí)現(xiàn)了基因組單堿基和短序列尺度的精準(zhǔn)編輯，基本解決了基因組精準(zhǔn)編輯的挑戰(zhàn)。然而，如何針對(duì)應(yīng)用場(chǎng)景的需求，實(shí)現(xiàn)大片段DNA在基因組的高效精準(zhǔn)整合，仍然是整個(gè)基因工程領(lǐng)域亟需突破的難題。該技術(shù)的突破意味著可以通過外源功能基因的精準(zhǔn)寫入，來干預(yù)多種不同位點(diǎn)基因突變導(dǎo)致的單基因遺傳缺陷等疾病，從而開發(fā)更為通用的基因與細(xì)胞療法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

針對(duì)這一重大技術(shù)挑戰(zhàn)，多種基因?qū)懭爰夹g(shù)已被開發(fā)，如CRISPR核酸酶介導(dǎo)的同源重組或非同源末端連接技術(shù)等，但是這些技術(shù)都依賴于DNA模板作為基因?qū)懭氲墓w（donor）。在實(shí)際醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，DNA供體面臨免疫原性高、在體（in vivo）遞送困難、在基因組中具有隨機(jī)整合風(fēng)險(xiǎn)等諸多挑戰(zhàn)。相比之下，RNA供體具有免疫原性低、可被非病毒載體（例如LNP）有效遞送、在細(xì)胞內(nèi)迅速降解，無(wú)隨機(jī)整合風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)，能有效應(yīng)對(duì)DNA供體所面臨的挑戰(zhàn)。

因此，以RNA為供體的大片段精準(zhǔn)寫入技術(shù)，在安全性、可遞送性方面都具有顯著的優(yōu)勢(shì)。然而，現(xiàn)有以RNA為供體的技術(shù)，要么無(wú)法實(shí)現(xiàn)>200 bp的DNA片段高效整合（如引導(dǎo)編輯等），要么依靠基因組隨機(jī)整合從而帶來基因組隨機(jī)突變風(fēng)險(xiǎn)（如逆轉(zhuǎn)錄病毒等）。是否能夠以RNA作為供體，實(shí)現(xiàn)功能基因尺度的大片段DNA基因組精準(zhǔn)定點(diǎn)整合？仍然是基因工程領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。

2024年7月8日，Cell雜志以長(zhǎng)文形式在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所/北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院李偉研究員與周琪研究員團(tuán)隊(duì)合作完成的題為All-RNA-mediated Targeted Gene Integration in Mammalian Cells with Rationally Engineered R2 Retrotransposons的研究論文。

該研究結(jié)合基因組數(shù)據(jù)挖掘和大分子工程改造等手段，開發(fā)了使用RNA供體進(jìn)行大片段基因精準(zhǔn)寫入的R2逆轉(zhuǎn)座子工具，能夠在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、原代細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大片段基因（>1.5 kb）高效精準(zhǔn)的整合，最高效率超過60%，成功實(shí)現(xiàn)了全RNA介導(dǎo)的功能基因（DNA）在多種哺乳動(dòng)物基因組的精準(zhǔn)寫入，為新一代創(chuàng)新基因療法的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。

作為基因組進(jìn)化的源動(dòng)力之一，轉(zhuǎn)座子可以通過在不同基因組間的"跳躍"，實(shí)現(xiàn)自我的復(fù)制與擴(kuò)增。

其中，以RNA作為媒介的R2逆轉(zhuǎn)座子的"跳躍"機(jī)制與以RNA作為供體的基因?qū)懭牍ぞ叩拈_發(fā)思路不謀而合。同時(shí)，該類逆轉(zhuǎn)座子天然傾向于整合在真核生物固定的28S rDNA基因組位點(diǎn)，這一位點(diǎn)在人基因組中拷貝數(shù)目多（約219個(gè)），且遠(yuǎn)離蛋白編碼基因，是適合于外源基因整合的安全港位點(diǎn)（"safe harbor" loci）。因此，R2逆轉(zhuǎn)座子是以RNA為供體的大片段基因?qū)懭牍ぞ唛_發(fā)的有力的候選者。然而，盡管R2逆轉(zhuǎn)座子早在上世紀(jì)80年代就被發(fā)現(xiàn)，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能性質(zhì)尚未被系統(tǒng)性地探索，迄今為止，未能被利用來在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)大片段功能基因的有效整合。

在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先通過數(shù)據(jù)挖掘，全面系統(tǒng)地分析了自然界中R2逆轉(zhuǎn)座子元件的生物多樣性；通過構(gòu)建基于RNA供體的基因?qū)懭氲膱?bào)告體系，成功篩選出在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有完整GFP功能基因整合活性的R2Tg系統(tǒng)（來源于一種鳥Taeniopygia guttata 的基因組）。隨后，研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)R2Tg系統(tǒng)發(fā)揮功能所必需的兩個(gè)關(guān)鍵組分：R2蛋白質(zhì)以及供體RNA，進(jìn)行了系統(tǒng)性的功能探索與工程化改造，最終獲得了在人細(xì)胞系中基因整合效率超過20%的en-R2Tg工具。

系統(tǒng)的工程化改造獲得en-R2Tg工具

由于R2蛋白質(zhì)可以通過mRNA表達(dá)，且供體RNA本身也是RNA，那么，en-R2Tg工具能否以全RNA形式介導(dǎo)的基因的高效精準(zhǔn)寫入？

為了探究這一點(diǎn)，研究人員通過體外合成獲得了編碼R2蛋白質(zhì)mRNA以及供體RNA，并使用脂質(zhì)體遞送的方式將兩條mRNA導(dǎo)入人的細(xì)胞中。結(jié)果顯示，en-R2Tg工具能夠高效整合多個(gè)與疾病治療相關(guān)基因，且這些基因能夠有效表達(dá)功能蛋白。能夠以全RNA的形式發(fā)揮功能，意味著en-R2Tg工具可以使用安全性已經(jīng)在臨床上得到證明的LNP納米材料來進(jìn)行遞送，這將有可能解決長(zhǎng)久以來基因?qū)懭牍ぞ咭蕾嚥《据d體進(jìn)行高效遞送的難題。

研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，使用LNP遞送en-R2Tg工具在人的肝臟細(xì)胞系中能夠?qū)崿F(xiàn)25%的基因整合效率。此外，研究團(tuán)隊(duì)還證明R2工具在人類原代細(xì)胞中同樣具有活性；同時(shí)，通過顯微注射將en-R2Tg工具導(dǎo)入小鼠胚胎，成功實(shí)現(xiàn)了超過60%的GFP基因定點(diǎn)整合效率。

本研究的另一關(guān)鍵點(diǎn)在于，工程化改造的en-R2Tg工具是否還保留有天然R2逆轉(zhuǎn)座子的28S rDNA位點(diǎn)特異性整合這一性質(zhì)？

為了回答這一問題，研究人員結(jié)合無(wú)偏好的基因整合富集高通量測(cè)序以及全基因組三代測(cè)序方法，發(fā)現(xiàn)en-R2Tg工具在全基因組范圍內(nèi)展現(xiàn)了極高的基因整合特異性，大于99%的外源基因都精準(zhǔn)整合到28S rDNA安全港位點(diǎn)。同時(shí)，結(jié)合qRT-PCR以及RNA-Seq實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)en-R2Tg工具對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)幾乎沒有影響。這說明 en-R2Tg 介導(dǎo)的基因?qū)懭胧俏稽c(diǎn)精準(zhǔn)特異的，可以有效避免逆轉(zhuǎn)錄病毒等技術(shù)所產(chǎn)生的基因隨機(jī)整合導(dǎo)致的基因突變風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，該研究基于自然界存在的R2逆轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，結(jié)合數(shù)據(jù)分析和工程化改造方法，成功開發(fā)了全RNA介導(dǎo)的、高效精準(zhǔn)的基因?qū)懭爰夹g(shù)，首次在多種人和小鼠細(xì)胞系及原代細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了功能基因的定點(diǎn)整合。R2基因精準(zhǔn)寫入工具在遞送和安全性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，未來有望基于此工具開發(fā)在體功能基因回補(bǔ)寫入以及在體生成CAR-T細(xì)胞等全新的疾病治療方法。值得注意的是，R2基因?qū)懭爰夹g(shù)目前無(wú)法實(shí)現(xiàn)在不同基因組位點(diǎn)的可編程寫入，且在人原代細(xì)胞中的基因?qū)懭胄瘦^低，因此未來需要進(jìn)一步發(fā)展和優(yōu)化。

開發(fā)全RNA介導(dǎo)的、高效精準(zhǔn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞大片段功能基因?qū)懭牍ぞ?span>

該研究由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所與北京干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院合作完成，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所博士后陳陽(yáng)燦、博士生駱勝球、博士后胡艷萍、博士生毛邦煒、王鑫閣與盧宗寶為本研究共同第一作者，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所李偉研究員與周琪研究員為共同通訊作者。該研究工作得到科學(xué)技術(shù)部、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、中國(guó)科學(xué)院、北京市自然科學(xué)基金等的大力支持。