來自上海的研究團(tuán)隊(duì)通過研究1月下旬至2月期間的新冠患者的病毒樣本，發(fā)現(xiàn)新冠病毒可劃分為兩大分支，分別從一個(gè)共同祖先獨(dú)立進(jìn)化而來。不過，這兩大分支病毒在臨床上對患者致病效應(yīng)無顯著區(qū)別。COVID-19疾病發(fā)展嚴(yán)重程度的決定因素主要還是與患者年齡、基礎(chǔ)疾病、淋巴細(xì)胞減少和相關(guān)的細(xì)胞因子風(fēng)暴等密切相關(guān)。

上述研究來自當(dāng)?shù)貢r(shí)間5月20日頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）以“加快評(píng)審文章 (Accelerated Article Preview) ”形式在線發(fā)表的一項(xiàng)研究，題為“Viral and host factors related to the clinic outcome of COVID-19”。該研究由來自復(fù)旦大學(xué)附屬上海市公共衛(wèi)生臨床中心、上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學(xué)研究所、醫(yī)學(xué)基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中科院植物生理生態(tài)研究所、上海巴斯德研究所和上海營養(yǎng)與健康研究所等多家上?？蒲泻歪t(yī)療單位合作完成。研究團(tuán)隊(duì)分析了1月下旬至2月期間，在上海公共衛(wèi)生臨床中心收治的326例新冠患者的SARS-CoV-2病毒樣本。

通訊作者為上海公共衛(wèi)生臨床中心黨委書記盧洪洲教授，中國工程院院士、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授、上海血液學(xué)研究所所長陳賽娟，與上海交通大學(xué)王升躍研究員。

研究團(tuán)隊(duì)對上海公共衛(wèi)生臨床中心于1月20日至2月25日期間收治的326例新冠肺炎確診病例的臨床、分子和免疫學(xué)資料進(jìn)行了分析。自1月27日收到第一批樣本起，瑞金醫(yī)院的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施重大疾病基因組研究平臺(tái)在一個(gè)多月時(shí)間內(nèi)完成了112個(gè)病例的SARS-CoV-2基因組高質(zhì)量測序。這些序列與全球流感數(shù)據(jù)共享計(jì)劃(GISAID)中的基因組序列類似，呈現(xiàn)較為穩(wěn)定地進(jìn)化過程，顯示該病毒可能在疫情早期就已適應(yīng)在人類宿主中傳播。

研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，疫情早期階段存在兩種有不同接觸史的主要病毒分支，但兩個(gè)分支的傳播性、致病性和臨床表現(xiàn)等方面無顯著差異，未發(fā)現(xiàn)與COVID-19重癥患者有顯著相關(guān)的病毒變異序列。

從臨床和免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者淋巴細(xì)胞明顯減少，尤其是重癥患者CD4+和CD8+T細(xì)胞呈顯著進(jìn)行性下降趨勢，且炎性細(xì)胞因子IL-6和IL-8明顯增高。

研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，COVID-19疾病發(fā)展嚴(yán)重程度的決定因素主要與患者年齡、基礎(chǔ)疾病、淋巴細(xì)胞減少和相關(guān)的細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)，這些因素成為疾病向重癥轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵預(yù)警因子。依據(jù)上述臨床分析采取早期針對性干預(yù)措施，將有助于阻止疾病向重癥發(fā)展。

新冠病毒穩(wěn)定進(jìn)化，可能在疫情早期已適應(yīng)在人類宿主中傳播

研究定義了四類感染病例。5例患者為無明顯發(fā)熱、呼吸系統(tǒng)癥狀或放射學(xué)表現(xiàn)的無癥狀患者。大部分患者（293例）為輕癥患者，有發(fā)熱和肺炎表現(xiàn)。12例為重癥患者，在24-48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)呼吸困難和肺內(nèi)毛玻璃樣陰影擴(kuò)大的癥狀。另有16例患者惡化為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），需要機(jī)械通氣或體外膜氧合（ECMO），屬于危重患者。

截至4月1日，315名患者（96.63%）已出院，6人（1.84%)死亡。

研究團(tuán)隊(duì)對112個(gè)樣本（痰、口咽拭子）進(jìn)行測序，與全球第一個(gè)公布的基因組（Wuhan-Hu-1）相比，在9個(gè)蛋白編碼區(qū)共鑒定出66個(gè)同義變異和103個(gè)非同義變異。ORF1ab、S、ORF3a、E、M和ORF7a的替換率相似（約3.5×10^-4每個(gè)位點(diǎn)每年），而ORF8（9.51×10^-4每個(gè)位點(diǎn)每年）和N（1.05×10^-3每個(gè)位點(diǎn)每年）的變異率更高。

在來自上海樣本基因組中重復(fù)出現(xiàn)的突變的與GISAID數(shù)據(jù)庫中已公布的病毒序列一致，呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的進(jìn)化過程，顯示該病毒可能在疫情早期就已適應(yīng)在人類宿主中傳播。

兩大分支新冠病毒，最早疫情發(fā)生并不局限于華南海鮮市場

隨后，研究團(tuán)隊(duì)使用了其中的94例病毒基因組和GISAID數(shù)據(jù)庫中的221個(gè)SARS-CoV-2序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。研究確定病毒主要為兩大分支，兩大分支中均包含來自20191年12月初診斷的病例；分支I包括幾個(gè)亞支，分支II與分支I的區(qū)別在于兩個(gè)相關(guān)的變異ORF8:p.84L>S (28144T>C)和ORF1ab:p.2839S (8782C>T)。

上海樣本的序列在兩個(gè)主要分支及其亞支中均有發(fā)現(xiàn)，研究認(rèn)為這表明上海的新冠病例有多個(gè)病毒來源。在上海沒有觀察到明顯的分支/亞支擴(kuò)張。

此外，確認(rèn)有華南海鮮市場接觸史的6位患者均集中在其中一個(gè)分枝中（分支 I），同期診斷的另外3例和華南海鮮市場沒有接觸史的病例均屬于分支II，提示疫情發(fā)生并不局限于華南海鮮市場。

論文指出，這兩種主要的單倍型可能代表了來自于2019年12月初在武漢由共同祖先獨(dú)立進(jìn)化而來的兩種譜系，其中只有一種（分支I）和華南海鮮市場接觸有關(guān)，市場內(nèi)密集的攤位、攤販和顧客可能促進(jìn)了人際傳播。

與此一致的是，一項(xiàng)針對12月18日前武漢地區(qū)最早的病例流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2例患者與華南海鮮市場有關(guān)聯(lián)，5例患者與之無關(guān)聯(lián)。他們的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，疫情最早可能發(fā)生在2019年11月下旬。

研究團(tuán)隊(duì)還比較了感染分支I或分支II病毒患者的臨床表現(xiàn)。他們發(fā)現(xiàn)，在疾病嚴(yán)重程度（p=0.88）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（p=0.79）、CD3 T細(xì)胞計(jì)數(shù)（p=0.21）、C反應(yīng)蛋白（p=0.83）或D-二聚體（p=0.19）以及發(fā)病后排毒時(shí)間（p=0.79）方面均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，這兩分支病毒盡管基因組序列發(fā)生變化，但表現(xiàn)出相似的致病效應(yīng)。

同樣，在疾病嚴(yán)重程度和13個(gè)最常見的變異（同義和非同義）之間也沒有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性。

與COVID-19疾病發(fā)展嚴(yán)重程度相關(guān)的宿主因素

這項(xiàng)研究的一個(gè)顯著特征是，部分感染者（5例，1.53%）雖然可以檢測到明顯的排毒，但未出現(xiàn)明顯癥狀。相比之下，在輕度和危重癥病例中觀察到肺部單側(cè)和雙側(cè)混濁病變，危重癥患者僅在兩天內(nèi)就迅速惡化。

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步分析了患者的免疫生化指標(biāo)。COVID-19的一個(gè)顯著特征是進(jìn)行性淋巴細(xì)胞減少，尤其是重癥和危重癥（入院后初步檢測結(jié)果，p=6×10^-6）。對淋巴細(xì)胞亞型的詳細(xì)分析顯示，CD3+ T細(xì)胞受影響最顯著（p<10^-6）， CD4+和CD8+ T細(xì)胞具有相似的趨勢（CD4+ T細(xì)胞，p<10-6；CD8+ T細(xì)胞，p=1×10^-5）。

值得注意的是，T淋巴細(xì)胞的變化不僅在危重病例中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且在其他三類（無癥狀、輕度和重度）中也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CD3+ T細(xì)胞，p=0.013；CD8+ T細(xì)胞，p=0.004）。相比之下，CD19+ B細(xì)胞雖然在危重患者中有顯著下降（p=1×10^-5），但在無癥狀、輕癥、重癥病例中無明顯變化（p=0.47）。

研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步檢查了每組數(shù)據(jù)后得出，隨著病情的惡化，CD3+ T淋巴細(xì)胞（在發(fā)病后第7、8、11、14-18、22-25、28、29天檢測）呈逐漸下降趨勢（p<0.05），CD4+和CD8+ T細(xì)胞也呈類似趨勢。然而，NK細(xì)胞（CD16+、CD56+）或B細(xì)胞（CD19+）沒有這種現(xiàn)象。

接下來，研究比較了共病組的臨床參數(shù)，發(fā)現(xiàn)雖然共病組的中位年齡較高（p=0.02），但共病組疾病進(jìn)一步發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)的確顯著提高（p=0.01）。事實(shí)上，單變量邏輯回歸分析表明年齡（p < 0.0001）、入院時(shí)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（p < 0.0001）,合并癥（p = 0.01）和性別（p = 0.014）都是與新冠嚴(yán)重程度相關(guān)的主要因素。多變量分析則表明,年齡（p = 0.002）和淋巴細(xì)胞減少（p = 0.002）是兩個(gè)主要的獨(dú)立因素，而合并癥沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

研究團(tuán)隊(duì)在入院和治療期間檢測了患者血清中11個(gè)細(xì)胞因子（IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17）的水平。其中，IL-6（p<10^-6）和IL-8（p=1×10^-5）變化最為顯著。值得注意的是，這兩種細(xì)胞因子與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

此外，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合各組細(xì)胞因子的縱向數(shù)據(jù)，繪制其隨發(fā)病后時(shí)間的波動(dòng)模式。他們收集了每位患者發(fā)病后第6天至第10天的最高IL-6數(shù)據(jù)，并將危重患者與非危重患者進(jìn)行了比較。危重癥患者組IL-6水平顯著升高（p=0.001）。從發(fā)病后第16天至第20天，患者IL-8水平也有類似的顯著差異（p=0.006）。

研究認(rèn)為，這些數(shù)據(jù)表明，炎癥細(xì)胞因子和SARS-CoV-2感染的發(fā)病機(jī)制之間有很強(qiáng)的聯(lián)系。

研究在討論環(huán)節(jié)指出，這項(xiàng)研究進(jìn)一步證實(shí)發(fā)現(xiàn)，CD3+ T細(xì)胞是感染患者的主要受抑制細(xì)胞類型，而CD19+ B細(xì)胞和CD16+CD56+NK細(xì)胞受抑制較少。事實(shí)上，淋巴細(xì)胞減少，尤其是CD4/CD8細(xì)胞數(shù)量減少，也是SARS-CoV-2感染的主要表現(xiàn)。

此外，研究對主要細(xì)胞因子的縱向監(jiān)測表明，IL-6和IL-8與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，IL-6動(dòng)力學(xué)與疾病嚴(yán)重程度高度相關(guān)。

當(dāng)然，目前病毒活性、細(xì)胞因子釋放與淋巴細(xì)胞減少的關(guān)系尚不清楚。研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)，包括“細(xì)胞因子風(fēng)暴”和CD3+ T淋巴細(xì)胞減少在內(nèi)的針對SARS-CoV-2的免疫病理反應(yīng)，可能至少在一定程度上構(gòu)成了疾病進(jìn)展和死亡的潛在機(jī)制。